Guo-Qiang Chen、分子生物学および翻訳科学の進歩、2011年ストレプトアビジンは細菌Streptomyces avidiniiから精製されています. 36ビオチンに対して非常に高い親和性を持ち、極端なpH、温度、有機溶媒、変性剤、洗剤、タンパク質分解酵素にも強い高親和性ビオチン結合剤として、分子生物学やバイオナノテクノロジーで広く使用されています。. ストレプトアビジンビーズを用いて固定化ビオチン化抗体を表示し、特定の抗原の存在を検出した。. 一般に、ストレプトアビジンビーズの調製にはタンパク質の生産、精製、化学的架橋プロセスが必要でした。. 36 PHAナノ粒子ベースのストレプトアビジン提示はストレプトアビジンビーズ調製のための単純化されたプロセスを提供した. ストレプトアビジンのC末端をPHAポリメラーゼのN末端に融合させて融合タンパク質を生成し、それがポリエステル重合を触媒し、同時にPHA顆粒表面にストレプトアビジンを提示した36(図3)。. 酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、DNA精製、酵素固定化およびフローサイトメトリープロセスにおけるストレプトアビジンを含む人工高分子ビーズのいくつかの応用が成功裏に開発された。. さらに、このようにして構築されたストレプトアビジンビーズは、操作された微生物によって効果的に生産され得、それはプロセスを単純化しそして生産コストを下げた。. Rusling、Methods in Enzymology、2016に、ストレプトアビジンMBはビーズの表面に共有結合した単層のストレプトアビジンを含む. このストレプトアビジン単分子層は、ビオチン化生体分子に対して高い親和性を示します(図1)。. ストレプトアビジンのビオチンへの結合は、フェムトモルの親和性定数を有する最も強力な既知の非共有結合の生物学的相互作用の1つである(Howarth et al。. ストレプトアビジン四量体がMBの表面に結合すると、ビーズの表面上の各ストレプトアビジン分子に利用可能な2つまたは3つのビオチン結合部位がある。. ビオチンに対するストレプトアビジンの高い親和性は、37℃で25分以内にビオチン化生体分子を捕捉することを可能にし、これはコンジュゲート調製時間を大幅に短縮する。. ストレプトアビジンMBコンジュゲートを調製する場合、MB:Ab2:HRPには1:2:4の比率をお勧めします。. ストレプトアビジン被覆MBの表面へのビオチン抗体とビオチン西洋ワサビペルオキシダーゼ標識の非共有結合.
ビオチン ストレプトアビジン 結合 ルールストレプトアビジンMBs(Dynabeads MyOneストレプトアビジンT1 product no)の中程度のスラリーをボルテックスする。. 微量遠心分離管を磁石(Invitrogen Dynal磁石)上に2分間置き、上清を捨てる。. 余分なストレージソリューションがストレプトアビジンMBから削除されていることを確認するためにさらに2回(ステップ3)を繰り返します. 02 1 mg / mL)の目的濃度の抗体(Ab2)、および80 Lのビオチン化HRP(2). 微量遠心チューブをその内容物(ストレプトアビジンMBビオチンAB2ビオチンHRP)と共に37℃で25分間、ゆっくりと回転させながらインキュベートする(Invitrogen Dynabeads MXミキサー)。. HRP MB Ab2バイオコンジュゲートを2分間マグネット(Invitrogen Dynalマグネット)上に置き、上清を捨てる. 十分に洗浄したら、HRP MB Ab2バイオコンジュゲートを200μLのOに再懸濁する。. HRP MB Ab2は、著しい性能低下なしに2週間使用することができる(Malhotra et al。. 野生型(WT)ストレプトアビジンを用いたコンジュゲーションスキームは、よく保存された生物学的条件下で非常に安定した結合を提供するため(Kd 10 15、pH 3 13)。 (Weber他. ストレプトアビジンは、サイズが5 nmの球状サブユニット構成を持つ60 KDaの四量体タンパク質です(Kuzuya et al. より弱い親和性およびpH依存性(pH9では5×10 8 M; pH 3では1×10 4 M)を示すビオチン類似体2−イミノビオチン(Katz、1997)、またはより弱い結合も示す単量体ストレプトアビジン突然変異体。 (Kd = 38 nM)(Lim et al. いくつかの技術は、WTタンパク質と同様のビオチン親和性を示すただ1つの機能的結合部位を有する四量体タンパク質の製造を可能にする(Howart et al。.ビオチン ストレプトアビジン 結合 しないNorthup、Methods in Enzymology、2002年において、標準的なアミンカップリングプロトコルを用いて、ストレプトアビジンはCM5センサーチップに架橋されている。. 簡単に説明すると、35μlの50mM NHS溶液および200mM EDCを注入する。. 005%Tween 20、溶液A)、続いて約25μlの50μg / mlストレプトアビジン(e。. 未反応のN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを、35μlの1Mエタノールアミン、pH9を注入することによりブロックする。. Regnier、Wonryeon Cho、プロテオミクスおよびメタボロームアプローチ、バイオマーカーディスカバリー、2013年アビジンおよびストレプトアビジンは、それぞれ約68および約60kDのホモ四量体であり、ビオチン解離定数は10〜15の範囲である。. アビジンはグリコシル化されているがストレプトアビジンはグリコシル化されていない. 脱グリコシル化アビジンは市販されており、NeutrAvidinとしても知られています。 . ストレプトアビジンのより中性に近いpIはクロマトグラフィー用途においてより低い非特異的結合を与える傾向があるので、この点は重要である。. アビジンおよびストレプトアビジンがビオチンに対してそのような莫大な親和性を有するという事実は、タンパク質分析において、主にアフィニティークロマトグラフィーにおいて、またビオチン化種を固定化するための手段としても広く利用されてきた。. ビオチンは様々な官能基を結合することができる小分子であるという事実に基づいて、ビオチンは広い範囲のタグ付け反応に使用できることを意味する. タンパク質およびペプチドの第一級アミン、スルフヒドリル、カルボキシル、またはカルボニル基へのビオチンの共有結合のための試薬は、複数の業者から入手可能である。. アビジンに関する大きな問題:ビオチンアフィニティークロマトグラフィーは天然の四量体アビジンカラムからビオチン化種を溶出することが困難である. 溶出条件が非常に厳しいため、その過程で機器、カラム、および分析物が害を受ける可能性があります.ビオチン ストレプトアビジン 結合 違いこの問題は、単量体アビジンまたはストレプトアビジンカラムを使用することで頻繁に解決されます。. 単量体アビジンは一般に四量体アビジンの解離によって産生されるが、単量体ストレプトアビジンは一般に組換えタンパク質として産生される。. 単量体アビジンに対するビオチンの結合親和性は四量体アビジンのそれよりはるかに低い. 単量体アビジン/ストレプトアビジンカラムの溶出は、弱酸または置換剤としてビオチンを使用することで達成できます。. 固定化アビジン/ストレプトアビジンマトリックスはビオチン化タンパク質や小さなリガンドの固定化にも有用です. アビジン/ストレプトアビジンがそのような高い親和性でビオチンに結合するという事実は、吸着剤からのビオチン化タンパク質の溶出を妨げる。. 例えば、アビジン/ストレプトアビジンマトリックスから抗体を溶出することなく、アビジン:ビオチン固定化抗体から抗原を解離させることができる。. いくつかの点でこれはアビジン/ストレプトアビジンマトリックスを普遍的な固定化マトリックスにする。. Sigworth、Methods in Enzymology、2010において、ストレプトアビジンは159残基の15-kDaタンパク質である(Sano et al。. それは両端で天然にタンパク質分解され、そしてこのタンパク質の最も安定でよく研究された形(コア - ストレプトアビジンと呼ばれる)は125 127の残基を含んでいる. 原子構造はX線回折によって決定されている(Hendrickson et al。. 他の構造(全長、ビオチン結合複合体、および変異体)もまた決定されている(Freitag et al。. ストレプトアビジンは、ビオチン化脂質の単層上に2D結晶を形成します。この集合体は電子結晶学によって研究されている(Avila-Sakar and Chiu、1996; Darst et al. 各サブユニットは一方の端に位置するビオチン結合部位を持つ - バレルを含んでいます。. 一つの結合ビオチンは空間充填モデルとして示され、そして他の三つの結合部位は星印で印を付けられている.ビオチン ストレプトアビジン 結合 マクロ(B)特異的ビオチンアビジン結合を介してストレプトアビジン分子を脂質単分子層に結合させることによって二次元結晶が形成される。. 黒い線はドメイン境界の輪郭を描き、矢印は各領域の結晶方位を示し、差し込み図は3つのクローズアップです。. 結晶成長時間は、2時間(破線)から6時間(実線)および一晩(データは示されていないが、結晶は直径2mの穴全体を0〜6時間)覆っていた。. 線は、それぞれ2D結晶(実線)および連続炭素支持体フィルム(破線)上のリポソーム密度を表す。. 投影写像における鏡面対称性のために、指数h + k = 2n + 1を有する反射スポットは存在しない。したがって、射影では、結晶はa = b = 5の正方格子を持つように見えます。. 2Dストレプトアビジン結晶は、有孔カーボンフィルムで被覆されたEMグリッドによって容易にピックアップされることが示されている(Avila-Sakar and Chiu、1996; Crucifix et al。. ガラス質氷中で急速凍結した結晶は原子分解能で電子線回折を示し(Avila-Sakar and Chiu、1996)、2D結晶は係留表面として有用であることが示されている(例えば、係留ビオチン化DNA分子)(Crucifixら)。. ストレプトアビジンはビオチンに対して高い親和性を持っていますが、さまざまな溶出条件を使用することができます(Fig。. 50 mM Tris HCl、1 mM EDTA、pH 8中の2 CVの5 CV. 0を加え、キャップを緩めにして圧力の上昇による漏れを防ぎ、カラムをきれいな微量遠心管の中に入れて漏れている可能性のあるサンプルをすべて集め、そしてアセンブリ全体を90℃で10分間加熱する。. 5 CVの8 M尿素、2%CHAPS、および50 mM DTTを、栓をしてゆるくキャップしたカラムに入れ、定期的に振盪しながら37℃で20分間加熱する。.ビオチン ストレプトアビジン 結合 日文、MS実験については、代替の溶出条件は、100mMグリシン、pH2とのインキュベーションを含む。. DCP - Bio1はエステル結合を含むので、DCP官能基を含む標識タンパク質は、2とのインキュベーションによってビオチン部分から切断することができる。. すべての溶出条件で、スピンカラムを1000 gで3分間遠心し、フロースルーを維持します. ストレプトアビジンビーズからビオチン化タンパク質を回収するための様々な溶出条件の使用. ビオチン化AhpC(180g)を、PBS(pH7)中の総容量250μlの2M尿素中、80μlのストレプトアビジンビーズと共にインキュベートした。. 2本を5本の異なるチューブに分注した後、1000gで2分間遠心分離して上清を除去した。. 溶出溶液(10μl)を各チューブに添加し、そして適切な温度で10分間インキュベートした。. 溶出条件は、50mMトリスHCl、1mM EDTA中2%SDS、pH8であった。. 0(90℃)。 2%CHAPSを含む8M尿素(37℃)。 8M塩酸グアニジン(GuHCl)(37℃)。 100 mMグリシン、pH 2. 2μlの溶出画分中のAhpCタンパク質の量をSDS PAGE後にクマシーブルー染色により可視化した。. DCP − Bio1で標識したスルフェン酸含有C165S AhpCをモノアビジンビーズと共に一晩インキュベートし、PBS緩衝液で3回洗浄し、そして別々のチューブに等分した。. 25M水酸化アンモニウムを24℃で16時間またはα−メルカプトエタノールを含有するSDS試料緩衝液中で10分間煮沸し、そして溶離液中のAhpCを(A)のように可視化した。.ビオチン ストレプトアビジン 結合 ソフト完全な章を読みます、2005年のBioanalysisの展望の中のEmil Pale ekアビジンとストレプトアビジンは、炭素で電気化学信号を生み出す電気活性種です(Havran等。. アビジン(ストレプトアビジン)ビオチン系に関する大量の電気化学的文献にもかかわらず、そのような変化はまだ報告されていない(Steiger et al)。. アビジンとストレプトアビジンのトリプトファン含有ビオチン結合ポケットは疎水性ボックスを形成する . アビジンまたはストレプトアビジンへのビオチンの結合は、溶媒への、そしてその結果としてPGE上での電気酸化へのTrp残基の接近可能性を減少させた。. 他方、ピークSの増加(図5B)およびより負の電位における触媒シグナルの減少(図6および7)は、表面でのタンパク質分子の配向および最終的にはいくつかの変化を考慮しなければほとんど理解できない。界面でのタンパク質の折りたたみ. 例えば、バイオセンサー中のアビジン標識DNAは、酵素アビジンコンジュゲートのような追加の標識を使用せずに検出され得る。. センサー内の水銀電極の難しさは、固体アマルガム電極を使用することによって克服されるかもしれません。. 、2002年。 Mikkelsen and Schroder、2003年。 Yosypchuk and Novotny、2002). Hashimoto Yasuhiro、Methods in Enzymology、2003で、オリゴ糖を還元剤としてピリジンボランを用いた還元的アミノ化によってストレプトアビジンに結合させる6. オリゴ糖(400〜800nmol)をストレプトアビジン(10nmol)と混合して26μlのO 2 O中に入れる。. 混合物を50℃で15分間インキュベートした後、4リットルのメタノール/ピリジンボラン(5:2)を添加する。. 得られたオリゴサッカリルストレプトアビジンを、Sephadex G - 25カラムクロマトグラフィーまたは超無料カートリッジ(Millipore Corp)を使用する限外濾過によって精製する。. 回収されたストレプトアビジンの量は、282nmでの吸光度またはビシンコニン酸アッセイ(Pierce)のいずれかによって決定される。.ビオチン ストレプトアビジン 結合 セル還元末端のグルコースを除くオリゴ糖構造の完全性は、気液カラムクロマトグラフィーを含む糖組成分析によってモニターされる。. 一般に、より大きな(ポリシアル)オリゴ糖のカップリングは、小さな(ポリシアル)オリゴ糖のカップリングよりも非効率的です。. それぞれの場合において、ストレプトアビジンに対するオリゴ糖のモル比は最適化されるべきです. 完全な章を読むクリス・レスリー、ニールス・ガルジャルト、Methods in Cell Biology、2013年ストレプトアビジンがインキュベートしている間に、80℃の冷凍庫からGMPCCP安定化MT種子を回収する. 冷凍庫からアリコートを取り出した後、37℃の加熱ブロックに入れるまで、手で暖めておくことが最善です。. 少量の種子原料を考えると、蒸発を避けるために加熱された蓋付きの加熱ブロックを使用するのが最善です。. これがシードストックの最初の使用である場合は、MTの整合性を確認する必要があります。. TIRFの設定では、512 512ピクセル、0のQuantEM 512SCカメラ(Roper Scientific)を使用します。. 通常、標準的なシードストックでは、これは1:130の希釈ですが、シードの調製に応じて1:100から1:160の範囲で希釈されます。. 通常、実験の前に最善の種子希釈をテストするためにいくつかのサンプルチャンバーを準備するのが最善です。. 希釈が得られたら、それは冷凍種子の全ストックに使用することができるので、正確であるために少し時間を投資する価値があります。. X‐ローダミンチューブリンで標識したGMPCCP安定化微小管種子のTIRF画像. 使用した画像形成条件は、3mW、561nmレーザー、100対物レンズ、500ms露光時間であった。. サンプルチャンバーを用意し、1リットルの種子を取り、必要に応じて温かいMRB80バッファーで希釈します。. ストレプトアビジン調製サンプルチャンバーへの50μlの希釈シードストックの流入.ビオチン ストレプトアビジン 結合 しない種が希釈されると、それらは不安定になるので、次回の実験には希釈した種溶液を使用しないでください(多数の実験を並行して実施する場合はもちろん1種の種希釈を使用するのが良いです)。. 反応液を5分間インキュベートし、サンプルチャンバーが室温になっていることを確認します(セクション1を参照). 最後に、30μlの温かい希釈カゼイン(これは、試料チャンバ表面へのさらなる結合を阻止するためのブロッキング剤として作用する)に流入し、そしてインビトロ試料の調製に進む。.
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May 2019
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